Regulacija diferencijacije stanica akutne promijelocitne leukemije koštanim morfogenetskim proteinima [Effect of bone morphogenetic proteins on differentiation of human promyelocytic leukemia cells]

Topić Grahovac, Iva (2013) Regulacija diferencijacije stanica akutne promijelocitne leukemije koštanim morfogenetskim proteinima [Effect of bone morphogenetic proteins on differentiation of human promyelocytic leukemia cells]. PhD thesis, Sveučilište u Zagrebu.

Preview

PDF Download (3MB) | Preview

Abstract

Acute promyelocytic leukemia (APL) is malignant hematologic disease characterized by translocation t(15;17). This translocation results in the formation of PML/RARα oncogene and accumulation of malignant promyelocytes that do not differentiate into mature granulocytes. Treatment of this type of leukemia is based on differentiation agents all-trans retinoic acid (ATRA) and arsenic-trioxide, which induce degradation and conformational changes of the oncogene PML/RARα. However, prolonged treatment with ATRA often results in relapse, due to development of ATRA resistance by leukemic cells, and serious side-effects. In this research we aimed to investigate possible mechanisms of BMP-mediated suppression of ATRA-induced differentiation using myeloid leukemia cell lines NB4 and HL60. We used two myeloid leukemia cell lines: NB4, which carries the specific t(15;17) translocation, and HL60, a myeloblastic leukemia cell line that lacks t(15;17) translocation, to test if the BMP effect is PML/RARα specific. Cell lines were treated with ATRA and BMPs, and, in some experiments, BMP-antagonists NOGGIN. ATRA induced differentiation of malignant promyelocytes into neutrophils in both tested cell lines. Addition of BMPs in ATRA-treated samples significantly reduced the percentage of differentiated cells. This anti-differentiation effect of BMPs was reversed by BMP-antagonist NOGGIN. To investigate the mechanism of anti-differentiation effect of BMPs on ATRA-treated myeloid leukemia cell lines NB4 and HL60, we analyzed the expression pattern of several genes involved in proliferation, differentiation and apoptosis, which are, at the same time, involved in both BMP- and ATRA-signaling pathway. Those in vitro results were confirmed in bone marrow and peripheral blood samples of APL patients. Gene expression analysis revealed induction of ID expression in both NB4 cell line and bone marrow APL samples. Addition of BMPs further enhanced ID gene expression in NB4 cells. Moreover, ATRA induced expression of differentiation genes PU.1 and C/EBPε. This effect was suppressed by combined treatment with ATRA and BMP. Also, we confirmed significant positive correlation between expression of total receptor RARα, important for differentiation effect of retinoic acid, and transcription factor PU.1 in bone marrow samples of APL patients. In the same samples, cKit expression negatively correlated with PML/RARα oncogene, but positively with total RARα, indicationg the role of cKit in differentiation of APL cells. Finally, the expression of total RARα was in negative correlation with BMP-6 and in positive correlation with BMP-antagonist BAMBI. Based on the obtained results, we concluded that ID genes and proteins could mediate antidifferentation effect of BMPs. Also, our findings suggest that PU.1 and C/EBPε could be responsible for the interference of BMP-signal and ATRA-differentiation effect. Results of our investigation confirmed the important role of BMPs in the pathogenesis of APL, and indicate that BMP molecules may be involved in the development of ATRA-resistance in APL patients.

Abstract in Croatian

Akutna promijelocitna leukemija (APL) je zloćudna hematološka bolest koju karakterizira translokacija t(15;17). Kao posljedica te translokacije nastaje onkogen PML/RARα. Time je onemogućena diferencijacija zloćudnih promijelocita u zrele granulocite. Liječenje bolesti temelji se na diferencijacijskoj terapiji all-trans retinoičnom kiselinom (ATRA) ili arsentrioksidom. Ti lijekovi potiču terminalnu diferencijaciju promijelocita u granulocite na način da dovode do degradacije i promjene konformacije onkoproteina PML/RARα. Međutim, u velikog broja bolesnika tijekom liječenja ATRA-om razvija se relaps bolesti i rezistencija na liječenje ATRA-om te po život opasne komplikacije. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi mehanizam kočenja diferencijacije stanica APL, potaknute ATRA-om, djelovanjem molekula BMP, uporabom mijeloidnih leukemijskih staničnih linija NB4 i HL60. Koristili smo dvije mijeloidne leukemijske linije: NB4, koja ima translokaciju t(15;17) i HL60, koja nema tu translokaciju, kako bi dokazali da učinak molekula BMP nije isključivo ovisan o izražaju onkoproteina PML/RARα. Stanične linije obrađivali smo ATRA-om i molekulama BMP te BMP-antagonistom NOGGIN. Obradom stanica mijeloidnih leukemijskih linija NB4 i HL60 ATRA-om dolazi do diferencijacije zloćudnih promijelocita u granulocite. Dodavanje molekula BMP u uzorke obrađene ATRA-om značajno se smanjuje udio diferenciranih stanica. Nasuprot tome, dodavanjem i BMP-antagonista NOGGIN poništava se anti-diferencijacijski učinak BMP-a. Da bi razjasnili mehanizam anti-diferencijacijskog učinka molekula BMP nakon obrade mijeloidnih leukemijskih linija ATRA-om, pratili smo obrazac izražaja gena važnih za diferencijaciju, proliferaciju, apoptozu, koji u isto vrijeme sudjeluju u signalnim putevima ATRA-e i BMP-a. Rezultate dobivene u uvjetima in vitro potvrdili smo u uzorcima koštane srži i periferne krvi bolesnika oboljelih od APL. Analizom genskog izražaja utvrdili smo da su geni ID pojačano izraženi u stanicama NB4 i uzorcima koštane srži bolesnika koji boluju od APL. Njihov izražaj u stanicama NB4 dodatno potiču molekule BMP. Nadalje, obradom stanica ATRA-om uočili smo pojačan izražaj diferencijacijskih gena PU.1 i C/EBPε, a taj učinak zakočen je djelovanjem molekula BMP. Dokazali smo i značajnu pozitivnu korelaciju izražaja ukupnog receptora RARα, koji posreduje diferencijacijski učinak retinoične kiseline, i transkripcijskog čimbenika PU.1 u uzorcima koštane srži bolesnika koji boluju od APL. U istim uzorcima izražaj gena za cKit negativno korelira s izražajem onkogena PML/RARα, a pozitivno s izražajem ukupnog RARα, što upućuje na ulogu cKit u diferencijaciji leukemijskih stanica. Također, izražaj ukupnog receptora RARα negativno korelira s izražajem gena za BMP-6, a pozitivno s izražajem gena za BMP-antagonist BAMBI. Na temelju navedenih rezultata zaključili smo da bi upravo geni, odnosno proteini ID, mogli posredovati anti-diferencijacijski učinak molekula BMP. Pri tome bi geni PU.1 i C/EBPε mogli biti odgovorni za interferenciju BMP-signala i diferencijacijskog djelovanja ATRA-e. Rezultati ovog istraživanja potvrđuju važnost djelovanja molekula BMP u patogenezi APL, te upućuju na zaključak da bi molekule BMP mogle pridonositi razvoju rezistencije na djelovanje ATRA-e u bolesnika oboljelih od APL.

Actions (login required)

View Item

Downloads